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糜蛋白酶活性检测试剂盒(微量法)
包装:100管/96样


产品介绍

糜蛋白酶,又称胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶,能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似,但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化,对脓性和非脓性痰液均有效;也用于创伤或手术后伤口愈合,如白内障摘除。

糜蛋白酶催化BTEE水解,产物在256nm有特征光吸收;通过测定256nm光吸收增加速率,来计算糜蛋白酶活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体100ml×1瓶2-8℃
试剂一液体10ml×1瓶2-8℃
试剂二粉剂×1瓶-20℃
试剂三液体5ml×1瓶2-8℃

溶液的配制:

1.试剂二:临用前溶于1.6 ml甲醇中,再用水定容至10ml。可分装后-20℃保存,避免反复冻融。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、粗酶液提取

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml试剂一进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清即粗酶液。

2.血清(浆):直接检测。

二、测定操作:

1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长到256nm,蒸馏水调零。

2.试剂一置于25℃水浴中保温30min。

3.操作表:

试剂名称(μL)测定管
试剂一90
试剂二90
试剂三20
样品20

将上述试剂分别加入微量石英比色皿/石英96孔板后充分混匀,于256nm处测定初始吸光值A1和3min时的吸光值A2,计算△A=A2-A1。

三、糜蛋白酶活性计算公式:

A、按微量石英比色皿计算:

1.按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃每毫克蛋白每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。

糜蛋白酶活(U/mg prot)= (△A×V反总÷ε÷d)÷(Cpr×V样)÷T=3.8×△A÷Cpr。

2.按样本质量计算

活性单位定义:25度每克样品每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。

糜蛋白酶活(U/g鲜重)=(△A×V反总÷ε÷d)÷(W×V样÷V提取)÷T=3.8×△A÷W。

3.按血清(浆)体积计算

活性单位定义:25℃每毫升血清(浆)每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。

糜蛋白酶活(U/ml )=(△A×V反总÷ε÷d)÷V样÷T=3.8×△A。

V样:加入反应体系中粗酶液体积,0.02ml;Cpr:粗酶液蛋白浓度,mg/ml,需要另外测定;W:样本鲜重,g;V反总:反应总体积,0.22 ml;V提取:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,3min;ε:BTEE消光系数:0.964 ml/μmol/cm;d:比色皿光径,1cm。

B、按96孔UV板计算:

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1.当△A大于0.15或者吸光值大于1时,建议将样品稀释后测定。

2.当△A小于0.04时,建议将样品浓缩或者增加样品体积进行测定,注意计算公式除以浓缩倍数或者改变体积。

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