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丙酮酸检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)
包装:100T


产品介绍

丙酮酸(Pyruvic acid,PA)又称 2-氧代丙酸,是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一,可通过乙酰辅酶 A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化,丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。丙酮酸是糖无氧代谢的产物,科研工作者常将丙酮酸和乳酸一起研究,并用二者的比值推算循环衰竭的程度。丙酮酸检测可采用乳酸脱氢酶催化法或二硝基苯肼比色法。

丙酮酸检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)检测原理是在酸性条件下,丙酮酸与二硝基苯肼反应,生成丙酮酸-二硝基苯腙复合物,后者经氧化呈棕红色,通过酶标仪测定

520nm处吸光度,据此通过与标准曲线对比可以计算出 PA水平。该试剂盒可用于检测植物、细胞或组织、血清等样品中内源性的丙酮酸含量,尤其适用植物样品丙酮酸含量的检测。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成:

试剂(A):丙酮酸标准(6mg/ml)1ml4℃避光
试剂(B):组织匀浆液(3×)100mlRT避光
试剂(C):苯肼显色液3ml4℃避光
试剂(D): PA Assay Buffer (1.5×)10mlRT
使用说明书1份

自备材料:

1、离心管或小试管

2、蒸馏水

3、酶标仪、96孔板

操作步骤(仅供参考):

1、配制组织匀浆液(1×):取 10ml组织匀浆液(3×)加入 20ml蒸馏水即成。

2、配制 PA Assay Buffer (1×):取 10ml PA Assay Buffer (1.5×)加入 5ml蒸馏水即成。

3、准备样品:

①血清、尿液及其他体液样品:血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,尿液通常也可以直接用于测定,-20℃冻存。

②组织样品:称取 1g组织样品置于匀浆器中,再加入 1ml组织匀浆液(1×)仔细研磨,振摇提取,静置 30min,取上清液 4000rpm离心 10min,取上清液,用组织匀浆液(1×)定容至 2ml,-20℃冻存,用于 PA的检测。

③植物材料:称取 1g植物材料置于匀浆器中,再加入 1ml组织匀浆液(1×)仔细研磨,振摇提取,静置 30min,取上清液 4000rpm离心 10min,取上清液,用组织匀浆液(1×)定容至 2ml,-20℃冻存,用于 PA的检测。

④高浓度样品:如果样品中含有较高浓度的 PA,可以使用原有的裂解液或 PBS等进行稀释,如鸡血清可稀释 5~10倍后检测。

4、配制标准品工作液:如果检测血清、尿液等样品,按取丙酮酸标准(6mg/ml):蒸馏水=1:99的比例配制,使浓度达到 60μg/ml;如果检测组织样品,按丙酮酸标准(6mg/ml):组织匀浆液(1×)=1:99的比例配制,使浓度达到 60μg/ml。 a、检测血清、尿液等样品时,用 96孔板按下表操作:

加入物(μl)123456
丙酮酸标准(60μg/ml,蒸馏水配制)2.557.5153045
蒸馏水72.57067.5604530
丙酮酸浓度(μg/ml)246122436

b、检测组织样品时,用 96孔板按下表操作:

加入物(μl)123456
丙酮酸标准(60μg/m,匀浆液配制)2.557.5153045
组织匀浆液(1×)72.57067.5604530
丙酮酸浓度(μg/ml)246122436

5、PA加样:按照下表设置空白孔、标准孔、测定孔,溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的 PA浓度过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定,样品的检测**能设置平行管。

a、检测血清、尿液等样品时,用 96孔板按下表操作:

加入物(μl)空白孔(血清等)标准孔测定孔
蒸馏水75
蒸馏水稀释后的各丙酮酸标准75
待测样品75
苯肼显色液252525
充分混匀
PA Assay Buffer125125125

b、检测组织样品时,用 96孔板按下表操作:

加入物/ml空白孔(组织等)标准孔测定孔
组织匀浆液(1×)75
匀浆液稀释后的各丙酮酸标准75
待测样品75
苯肼显色液252525
充分混匀
PA Assay Buffer125125125

6、PA测定:混匀静置 10min,其中空白孔呈无色或淡黄色,标准孔依次呈不同程度的棕红色。以空白孔调零,酶标仪 520nm读取标准孔、测定孔的吸光度值(记为 A标准、A测定)。

计算:

以各丙酮酸标准浓度(1~6号)为横坐标,以对应各丙酮酸标准 A标准为纵坐标,绘制丙酮酸标准曲线,血清、尿液等的丙酮酸含量直接根据标准曲线求得。

组织丙酮酸(μg/g)=A×N/m

血清丙酮酸(μg/ml)=A×N

式中:A=通过标准曲线计算样品的丙酮酸浓度(μg/ml)

N=稀释倍数

m=样品的质量(g)

注意事项:

1、所加试剂顺序不可颠倒,先加丙酮酸标准液或待测液,再加组织匀浆液(1×),最后加 PA Assay Buffer(1×)。

2、配制的丙酮酸标准(60μg/m)应 4℃避光保存,24h有效。

3、组织匀浆液有腐蚀性,应小心操作。

4、健康成年人空腹静脉全血丙酮酸含量为 3~9μg/ml。

5、如果没有酶标仪,也可以使用分光光度计测定,检测样品量会相应减少。

6、标准曲线的各点应分布均匀,范围适中。

7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期:6个月有效。4℃运输,4℃保存。

附录:参考标准曲线范围:Leagene在室温条件下通过酶标仪 520nm测定丙酮酸标准在1~60μg/ml时,其吸光度多在 0.10~2.40之间。根据 Leagene测定丙酮酸标准在 1、2、4、6、12、24、36、48、60μg/ml时的吸光度,作出标准曲线如下:

注意:由于检测仪器和操作手法等条件的不同,参考值范围会有波动,该值仅供参考,对于要求精确计算丙酮酸含量的,可以采用多点标准曲线重复测定;根据 Leagene测定经验显示,标准品浓度在 1μg/ml以下,标准品浓度在 60μg/ml以上,标准曲线会有偏差。

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