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果胶裂解酶活性检测试剂盒(微量法)
包装:100管/96样


产品介绍

果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是果胶酶的重要组成部分,催化果胶分子链的消除裂解。来源比较广泛,主要来源于微生物,在食品加工工业中提高果汁产量方面有重要意义,在减少环境污染和降低能源消耗方面也具有潜在的应用价值。

果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键,生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸,在235nm处有特征吸收峰,测定235nm下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体120ml×1瓶2-8℃
试剂一液体15ml×1瓶2-8℃

溶液的配制:

试剂一:溶液中如果有沉淀存在,可以50℃水浴助溶。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤 (仅供参考) :

一、样品处理理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液),进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。

3.培养液:直接测定。

二、测定步骤

1.分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 235nm,蒸馏水调零。

2.操作表:

试剂名称(μL)测定管空白管
试剂一180180
酶液20-
蒸馏水-20
充分混匀后测定 235nm下的初始值 A1,40℃反应 30min后再次测定吸光值 A2,

计算ΔA测定管=A2测定管-A1测定管,ΔA空白管= A2空白管-A1空白管,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。

三、果胶裂解酶活性计算

A、按微量石英比色皿计算:

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5条件下,每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=64.1×ΔA÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5条件下,每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×W÷V样总)÷T= 64.1×ΔA÷W

3.按照细菌、真菌数量计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5条件下,每 104个细胞每分钟分解果胶产生 1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性(U/104cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T= 64.1×ΔA÷细胞数量

4.按照培养液体积计算

酶活性定义:在 40℃,pH5.5条件下,每毫升培养液每分钟分解果胶产生 1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷V样÷T= 64.1×ΔA

ε:不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数:5200L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应总体积,0.0002L;V样:反应体系中样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W,样本质量,g;T:反应时间,30min;109:换算系数,1mol=109nmol。

B、按 96 UV 板计算:

将上述公式中的 d-1cm修改为 d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1.若ΔA大于 0.5,将粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。若 A测定管大于 1.5时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。

2.建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。

3.空白管正常情况下变化不超过 0.02。

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