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果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)检测试剂盒(UV板,微量法)
包装:100管/96样


产品介绍

果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6 bispHospHate aldolase,FBA)(EC 4.1.2.13)是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与calvin循环的重要酶,催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛,广泛存在于动植物及微生物体内,在各种逆境胁迫下表现不同的响应。

果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙酮生成NAD和α-磷酸甘油,340nm处吸光值的变化可反映果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液一液体110ml×1瓶2-8℃
提取液二液体110ml×1瓶2-8℃
试剂一液体10ml×1瓶2-8℃
试剂二粉剂×1瓶-20℃
试剂三粉剂×1瓶2-8℃
试剂四液体×1支2-8℃
试剂五液体×1支-20℃

溶液的配制:

1.试剂二:临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

2.试剂三:临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

3.试剂四:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

4.试剂五:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。

操作步骤 (仅供参考) :

一、样品处理理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

①总 FBA酶:

组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液一)充分冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液一),冰浴超声波破碎细菌或细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。液体:直接检测。

②胞浆和叶绿体 FBA酶的分离:

(1)按照植物组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5-10的比例(建议称取约 0.1g样本,加入 1ml提取液一),手工快速研磨或匀浆,之后于 4℃,200g离心 5min;

(2)弃沉淀,取上清在 4℃,8000g离心 10min(离心时缓慢加速和降速);

(3)取上清用于测定胞浆 FBA酶活性,取沉淀加 1ml提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g离心 10min,上清即为叶绿体中 FBA酶活性。

建议测定总 FBA 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBA,则按照步骤②提取粗酶液。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2.样本测定:(在微量石英比色皿/96孔 UV板中分别加入下列试剂)。

试剂名称(μL)测定管空白管
试剂一100100
试剂二2020
试剂三2020
试剂四2020
试剂五2020
样本20-
蒸馏水-20
充分混匀后于 340nm处测定 10s时的吸光值 A1,迅速置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)水浴 5min(有控温功能的酶标仪可以将温度调至 37℃或者25℃),拿出迅速擦干测定 310s时的吸光值 A2,分别记为 A1测定、A2测定、 A1空白和 A2空白,计算ΔA测定管=A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做 1-2次)

注意:如果检测样本量大,可以将试剂一、二、三、四、五按照 5:1:1:1:1(V:V:V:V:V)的比例配成工作液待用(现配现用)。

三、FBA 含量计算

A、按微量石英比色皿计算:

(1)按蛋白浓度计算

酶活单位定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算

酶活单位定义:每 g组织每分消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照细胞或细菌数量计算

酶活单位定义:每 104个细胞或细菌每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷细胞数量(万个)

(4)按液体体积计算

酶活单位定义:每 ml液体每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

B、按 96孔 UV板计算:

将上述公式中的 d-1cm改为 d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1.若ΔA大于 0.8建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.若是植物样本,建议在提取完成后 2h内检测完,如果样本量过大,建议分批提取、检测。

3.由于提取液一中含有一定浓度的蛋白(约 0.5mg/ml),所以在测定样品蛋白浓度是需要减去提取液本身的蛋白含量。

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