果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)检测试剂盒(UV板,微量法)
产品介绍
果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6 bispHospHate aldolase,FBA)(EC 4.1.2.13)是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与calvin循环的重要酶,催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛,广泛存在于动植物及微生物体内,在各种逆境胁迫下表现不同的响应。 果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙酮生成NAD和α-磷酸甘油,340nm处吸光值的变化可反映果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 产品组成:
溶液的配制: 1.试剂二:临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 2.试剂三:临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 3.试剂四:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 4.试剂五:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 试验中所需的仪器和试剂: 紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。 操作步骤 (仅供参考) : 一、样品处理理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) ①总 FBA酶: 组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液一)充分冰浴匀浆,然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。 细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液一),冰浴超声波破碎细菌或细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。液体:直接检测。 ②胞浆和叶绿体 FBA酶的分离: (1)按照植物组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5-10的比例(建议称取约 0.1g样本,加入 1ml提取液一),手工快速研磨或匀浆,之后于 4℃,200g离心 5min; (2)弃沉淀,取上清在 4℃,8000g离心 10min(离心时缓慢加速和降速); (3)取上清用于测定胞浆 FBA酶活性,取沉淀加 1ml提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g离心 10min,上清即为叶绿体中 FBA酶活性。 建议测定总 FBA 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBA,则按照步骤②提取粗酶液。 二、测定步骤 1.分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。 2.样本测定:(在微量石英比色皿/96孔 UV板中分别加入下列试剂)。
注意:如果检测样本量大,可以将试剂一、二、三、四、五按照 5:1:1:1:1(V:V:V:V:V)的比例配成工作液待用(现配现用)。 三、FBA 含量计算 A、按微量石英比色皿计算: (1)按蛋白浓度计算 酶活单位定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。 FBA酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr (2)按样本质量计算 酶活单位定义:每 g组织每分消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。 FBA酶活(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W (3)按照细胞或细菌数量计算 酶活单位定义:每 104个细胞或细菌每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。 FBA酶活(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷细胞数量(万个) (4)按液体体积计算 酶活单位定义:每 ml液体每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。 FBA酶活(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。 B、按 96孔 UV板计算:将上述公式中的 d-1cm改为 d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。 注意事项: 1.若ΔA大于 0.8建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。 2.若是植物样本,建议在提取完成后 2h内检测完,如果样本量过大,建议分批提取、检测。 3.由于提取液一中含有一定浓度的蛋白(约 0.5mg/ml),所以在测定样品蛋白浓度是需要减去提取液本身的蛋白含量。 |
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