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果糖-1,6-二磷酸(FDP)检测试剂盒(微量法)
包装:100管/48样


产品介绍

果糖-1,6-二磷酸(FDP)检测试剂盒(微量法)

果糖1,6-二磷酸(fructose-1,6-dipHospHate, FDP)是糖酵解过程中的一种重要的中间产物,对多种酶具有调节作用,具有改善细胞能量代谢、增加能量利用、抗心律失常及抗组织过氧化等作用,广泛应用于临床医药。

醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸裂解,产物与2,4-二硝基苯肼在酸性介质中反应生成2,4-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈红棕色,在540nm处有特征吸收峰。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液一液体60ml×1瓶2-8℃
提取液二液体10ml×1瓶2-8℃
试剂一液体10ml×1瓶2-8℃
试剂二粉剂×1支2-8℃
试剂三液体7ml×1瓶2-8℃
试剂四液体20ml×1瓶2-8℃
标准品粉剂×1支2-8℃

溶液的配制:

1.试剂二:临用前加入300μL蒸馏水,充分溶解后待用,用不完的试剂4℃保存,4℃保存一周;

2.标准品:临用前加入1176μL蒸馏水充分溶解,配制成50μmol/ml果糖-1,6-二磷酸标准溶液。

试验中所需的仪器和试剂:

可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤 (仅供参考) :

一、样品处理理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照质量(g):提取液一体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g,加入 1ml提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于 4℃,12000g离心 10min,取 0.8ml上清液,再加入 0.16ml提取液二,4℃,12000g离心 10min后取上清待测。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液一体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液一)加入提取液一,冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);于 4℃,12000g离心 10min,取 0.8ml上清液,再加入 0.16ml提取液二,4℃,12000g离心 10min后取上清待测。

3.血清(浆):取 100μL血清(浆)加入 1ml提取液一,4℃,12000g离心 10min,取 0.8ml上清液,再加入 0.16ml提取液二,4℃,12000g离心 10min后取上清待测。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。

2.将 50μmol/ml的果糖-1,6-二磷酸标准液用蒸馏水倍比稀释为 3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1μmol/ml

的标准溶液备用。

3.样本测定:(在 1.5 ml离心管中操作)

试剂名称(μL)对照管测定管空白管标准管
样本2020--
蒸馏水--20-
标准溶液---20
试剂一44404440
试剂二-4-4
充分混匀,37℃准确反应 2 h
试剂三40404040
充分混匀,37℃准确反应 20 min
试剂四100100100100
充分混匀,37℃准确反应 10 min
于微量玻璃比色皿/96孔板中测定 540nm处吸光值 A,分别记为 A对照管、A测定管、A空白管和 A标准管。计算ΔA=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。(空白管只需检测 1-2次)。

三、FDA 含量计算

1.标准曲线的绘制:

以各个标准溶液的浓度为 x轴,其对应的ΔA标准为 y轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y= kx+b,将ΔA带入方程得到 x(μmol/ml)。

2.FDP含量的计算:

(1)按样本质量计算

FDP含量(μg/g质量)=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=408x÷W

(2)按细胞数量计算

FDP含量(μg/104cell)=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×细胞数量(万个)) =408x÷细胞数量(万个)

(3)按液体体积计算

FDP含量(μmol/ml)=x×(V上清+V提取液二)÷ [V液体×V上清÷(V提取液一+V液体)]=13.2x

V上清:提取时上清液体积,0.8ml;V提取液二:提取液二的体积,0.16ml;V提取液一:提取液一的体积,1ml;W:样本质量,g;M:果糖-1,6-二磷酸分子质量,340;V液体:液体样本体积,0.1ml。

注意事项:

1.当ΔA测定大于 0.5时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。

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