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单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性检测试剂盒(紫外分光光度法)
包装:50管/48样


产品介绍

MDHAR催化MDHA还原生成AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+,NADH在340nm有特征吸收峰,但是NAD+没有。通过测定340nm光吸收下降速率,来计算出MDHAR活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体60ml×1瓶4℃
试剂一液体30ml×1瓶4℃
试剂二粉剂×1瓶4℃
试剂三粉剂×1瓶-20℃
试剂四液体×1瓶-20℃

溶液的配制:

1.试剂二:临用前加入5ml蒸馏水充分溶解,4℃保存;

2.试剂三:临用前加入5ml蒸馏水充分溶解,可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融;

3.试剂四:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加5ml试剂一充分溶解,可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。

需自备的仪器和用品:

研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1ml石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水。

操作步骤:

一、样本处理理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液)进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。

2.细菌、细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500-1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声破碎细胞(功率300w,超声3s,间隔7s,总时间3min);然后10000rpm,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1.分光光度计预热30min,调节波长到340nm,蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃水浴锅中预热30min。

3.依次在石英比色皿中加入下列试剂

试剂名称(μL)空白管测定管
试剂二100100
试剂三100100
试剂四100100
试剂一400400
蒸馏水300
上清液
300

迅速混匀后于340nm比色,记录30s和150s的吸光值。分别记为A1、A2,ΔA=A1-A2,得到ΔA测定管、ΔA空白管。

三、MDHAR活性计算:

1.按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。

MDHAR (U/mg prot) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

2.按样本质量计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每克样本每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。

MDHAR (U/g质量) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W

3.按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。

MDHAR (U/104cell) =[ (ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量

ε:NADH摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;V反总:反应体系总体积,1ml=0.001L;V样:加入反应体系中上清液体积,300μL=0.3ml;V样总:提取液体积,1ml;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/ml,蛋白质浓度需要另外测定;W:样本质量,g;细胞数量:以104为单位计量,万个;T:反应时间,2min。

注意事项:

1.当ΔA测定大于0.3时,建议客户稀释样本或者调整试剂一和上清液的比例(如将400μL试剂一+300μL上清液改为600μL试剂一+100μL上清液)后进行测定。

2.当ΔA测定过小时,建议客户提高样本量或者调整试剂一和上清液的比例(如将400μL试剂一+300μL上清液改为 200μL试剂一+500μL上清液)。

3.当A1大于1.5时,建议将样本稀释进行测定。

4.空白管为检测各管试剂组份的检测孔,正常情况下,其OD值在0.5左右,变化不超过0.01。

5.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/ml),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

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