注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

GBSS(EC 2.4.1.21)以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。

GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADpH，其中NADpH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADpH的增加量，可以计算GBSS活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂四：临用前每支加入5ml试剂一。

2.试剂五：临用前每支加入10ml试剂一。

3.试剂六：临用前取1支加入208 μL双蒸水，充分溶解备用，用不完的试剂4℃保存。

4.试剂八：每支临用前加入溶解好的4ml试剂四。

5.反应液Ⅰ的配制：临用前在试剂二中加入14ml试剂一，缓慢加热，逐渐升温使其溶解，冷却后加入试剂三混合溶解，这样可以分两批配制并且测定。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

称取约0.1g组织加入1ml提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1ml提取液充分混匀，置冰上待测。

二、测定步骤

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.在EP管中按顺序加入下列试剂

混匀后立即转移200μL至微量石英比色皿或96孔板中，340nm波长下记录初始吸光度A1和2min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

三、GBSS活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在1ml反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

GBSS活性(U/mg prot)= [ΔA÷(ε×d)×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清)÷T=43.2×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2.按照样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

GBSS活性(U/g鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清)÷T= 43.2×ΔA÷W 。

V测：测量体积，0.26ml；V样：加入样本体积，0.1ml；V反总：反应体积，0.31ml；V上清：加入上清液体积，0.15ml；V提取：加入提取液体积，1ml；ε：NADpH摩尔消光系数，6.22×10^-3ml/nmoL/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量，g。

b.使用96孔板测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

GBSS活性(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清)÷T =72×ΔA÷Cpr。此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2.按照样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

GBSS活性(U/g鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清)÷T=72×ΔA÷W。

V测：测量体积，0.26ml；V样：加入样本体积，0.1ml；V反总：反应体积，0.31ml；V上清：加入上清液体积，0.15ml；V提取：加入提取液体积，1ml；ε：NADpH摩尔消光系数，6.22×10^-3ml/nmoL/cm；d：比色皿光径，0.6cm；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量，g。