丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的**个限速酶。

PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂三：临用前加入5ml蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2.试剂四：临用前加入5ml蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3.试剂六：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前按试剂六：试剂六稀释液=1.6:660(V:V)的比例稀释试剂六备用，现用现配；

4.工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1的体积比例充分混匀，现用现配。

所需的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1ml石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2.     4℃1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃11000g离心15min。

3.上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC(此步可选做，可以判断线粒体提取效果)。

4.在沉淀中加入1ml提取液，超声波破碎(功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复12次)，用于PC活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.试剂一用前37℃孵育15min。

3.操作表：在1ml石英比色皿中分别加入下列试剂：

三、PDC活性计算

单位的定义：每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PC酶活(U/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(V样×Cpr)÷T=1607×ΔA÷Cpr

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；V样：反应体系中样本体积，0.05ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；T：反应时间：2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，ΔA大于0.8时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间(5min或10min)来测定。

2.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.05。

3.样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度(约1mg/ml)，所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

4.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

5.本试剂盒试剂足够完成50管反应。

6.附:使用样本重量计算公式：(样本检测数为50T/24S)。

A、上清中PC活力的计算:

酶活定义：每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PC酶活(U/g质量)=ΔA1÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T= 1607×ΔA1÷W

ΔA1：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；V样：反应体系中样本体积，0.05ml；V提取：加入的提取液体积，1ml；T：反应时间：2min；W：样本质量，g；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

B、沉淀中PC活力的计算:

酶活定义：每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PC酶活(U/g质量)=ΔA2÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T = 1607×ΔA2÷W

ΔA2：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；V样：反应体系中样本体积，0.05ml；V提取：沉淀重悬体积，1ml；T：反应时间：2min；W：样本质量，g；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

样本PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。

按样本质量计算：PC(U/g质量)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W