GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中，和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。

GOGAT以NADH为电子供体，催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸，NADH在340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

工作液的配制：取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入10ml试剂一中溶解，现用现配，可分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤 (仅供参考) ：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1.紫外分光光度计/酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，分光光度计蒸馏水调零。

2.工作液提前配置，平衡至室温。

3.样本测定：

三、GOGAT活性计算

a.按微量石英比色皿计算

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(V样×Cpr)÷T=321.5×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算：

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.5×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT(U/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.643×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol =109nmol。

b.按 96孔 UV板计算：

将上述公式中的 d-1cm改为 d-0.6cm(96孔 UV板光径)进行计算即可。

注意事项：

1.测定期间样本在冰上放置，以免变性和失活。

2.**两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3.当 A1大于 1.5或者ΔA大于 0.6(酶标仪ΔA大于 0.4)时，建议将样本用蒸馏水稀释后测定，当ΔA过小时，可以延长酶促反应时间(10min或 15min)或者加大加入的样本体积进行测量。

4.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/ml)，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。