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α-淀粉酶活性检测试剂盒(微量法)
包装:100管/48样


产品介绍

淀粉水解酶,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖,还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质,在540nm有吸收峰;通过测定540nm吸光度增加速率,计算淀粉酶活性。α-AL耐热,但是β-淀粉酶可在70℃钝化15min。因此粗酶液经过70℃钝化15min,就只有α-AL能够催化淀粉水解。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
试剂一液体20ml×1瓶室温
试剂二粉剂×1瓶2-8℃
标准品粉剂×1支2-8℃

溶液的配制:

1.试剂一:若有黄色晶体析出,需加热溶解后再用;

2.试剂二:临用前加入10ml蒸馏水,置于常温水中并加热至煮沸,期间不断搅拌粉剂至溶解;

3.标准品:10mg无水葡萄糖。临用前加1ml蒸馏水,配成10mg/ml葡萄糖标准液。

需自备的仪器和用品:

酶标仪或可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

称取约0.1g样本,加0.8ml蒸馏水匀浆;匀浆后在室温下放置提取15min,每隔5min振荡1次,使其充分提取;6000g,室温离心10min,吸取上清液并且加蒸馏水定容至10ml,摇匀,即为淀粉酶原液。

二、测定步骤

1.分光光度计预热30min以上,调节波长到540nm,蒸馏水调零。

2.将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/ml的标准溶液。

3.取250μL样本沸水浴5min作为对照管使用。

4.按照操作表依次加入各个试剂:

试剂(μL)对照管测定管标准管空白管
α-淀粉酶原液75(煮沸样本)75--
蒸馏水---75
标准溶液--75-
70℃水浴15min左右,冷却
试剂二-75--
在40℃恒温水浴中准确保温5min
试剂一150150150150
试剂二75-7575

混匀,沸水浴10min,取200μL至96孔板或微量比色皿中,540nm处读取对照管、测定管、标准管、空白管的吸光度,分别记为A对照、A测定、A标准和A空白,计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA标准=A标准-A空白。

三、α-淀粉酶活性计算

1、标准曲线的绘制:以ΔA标准为y轴,以标准溶液浓度为x轴,绘制标准曲线,得到方程y=kx+b 。将ΔA测定带入方程得到x(mg/ml)。

2、 α-淀粉酶活性的计算:

(1)按照样本质量计算单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g质量)=x×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=2×x÷W

(2)按照蛋白质浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1m还原糖定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V样÷(V样×Cpr)÷T=0.2×x÷Cpr

V样:加入反应体系中样本体积,0.075ml;V样总:提取液总体积,10ml;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。

注意事项:

测定的吸光值大于1.5时,可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小,可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。

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