注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

提取液：液体100ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入12ml双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体15ml×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体15ml×1瓶，4℃保存。

标准品：液体×1支，5μmol/ml的对硝基苯酚溶液。

产品说明：

α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化水解芳基或烃基与糖基之间的α-糖苷键生成葡萄糖，不仅与细胞壁的松弛或加固有关，而且与细胞识别和一些信号分子产生密切相关。

α-GC分解对-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GC活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每1000万细菌或细胞加入1ml提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次)，15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：称取约0.2g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

3、标准样品的准备：取100μL标准液，加入到400μL试剂三中，得到1μmol/ml标准液，十倍稀释到100nmol/ml，用蒸馏水倍比稀释：50、25、12.5、6.25、0 nmol/ml。100、50、25、12.5、6.25、0 nmol/ml做标准液。

二、测定步骤和加样表：

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2.加样表

充分混匀，放入37℃准确水浴30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)

充分混匀，室温静置2min后， 400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。

三、α-GC 活力计算：

1、标准曲线建立：根据标准管的浓度(y)和吸光度(x，各标准管减去浓度为0的标准管为标准管A)，建立标准曲线。

2、根据标准曲线，将ΔA(x)带入公式计算样品产物浓度(nmol/ml)。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每ml体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

GC活力(U/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=18.67×y÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每ml体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

GC活力(U/g鲜重) = (y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=18.67×y÷W

(3)按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每ml体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

GC活力(U/10⁴ cell)=(y×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.0187×y

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；V反总：反应体系总体积，0.28ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.03ml； V样总：加入提取液体积，1ml；W：样品质量，g；1000：细胞或细菌总数，1000万；T：反应时间，0.5h。