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α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性检测试剂盒(紫外分光光度法)
包装:50管/48样


产品介绍

α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH,NADH在340nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
试剂一液体60ml×1瓶4℃
试剂二液体0.6ml×1瓶-20℃
试剂三液体55ml×1瓶4℃
试剂四粉剂×1支4℃
试剂五粉剂×1支4℃
试剂六粉剂×1支-20℃
试剂七粉剂×1支-20℃
试剂八粉剂×1瓶-20℃

溶液的配制:

1.试剂八:临用前加入2ml双蒸水充分混匀待用,用不完的试剂仍-20℃避光保存。

2.工作液的配制:临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1ml石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤(仅供参考):

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

称取约0.1g组织或收集约500万细胞,加入1ml试剂一和10μL试剂二,冰浴用匀浆器或研钵充分研磨,4℃ 11000g离心10min,取上清,置冰上待测。

二、操作步骤

1.分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.空白管:取1ml工作液加入1ml石英比色皿,37℃孵育5min后取出比色皿,再依次加入40μL试剂八和60μL蒸馏水,混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1,37℃准确反应2min,记录340nm处2min时的吸光值A2,计算ΔA空白=A2-A1。

3.测定管:取1ml工作液加入1ml石英比色皿,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min后取出比色皿,再依次加入40μL试剂八和60μL样本,混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确反应2min,记录340nm处2min时的吸光值A4,计算ΔA测定=A4-A3。

三、α-KGDH活性计算

1.按样本蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(U/104cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=2.977×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总:反应体系总体积,1.1×10-3L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积,0.06ml;V样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01ml;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

注意事项:

1.测定过程中所有试剂和样本在冰上放置,以免变性和失活。

2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3.**两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

4.测定管的ΔA值在0.01-0.25之间,若测定管的ΔA值大于0.25,需将样本进行稀释。

5.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/ml),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

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