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UDPG焦磷酸化酶(UPG)检测试剂盒(微量法)
包装:50管/48样


产品介绍

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyropHospHospHprylase,UGP,EC 2.7.7.9)在自然界广泛分布。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化,将1-磷酸葡萄糖与UTP分子合成为UDP-葡萄糖(UDPG),UDPG是高等植物和动物中主要活化酶的形式,作为葡萄糖基供体参与糖原、蔗糖、纤维素等的合成代谢。

UGP可逆的催化生成1-磷酸葡萄糖,其在磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将NADP转化为

NADpH,UGP活性可以用340nm的吸光值的变化来反应。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体110ml×1瓶4℃
试剂一粉剂×1瓶-20℃
试剂二粉剂×1瓶4℃
试剂三粉剂×1支-20℃
试剂四粉剂×1支-20℃
试剂五液体2.5ml×1瓶4℃
试剂六液体5ml×1瓶4℃

溶液的配制:

1.试剂一:临用前加15ml蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,-20℃保存2周。

2.试剂二:临用前加2.5ml蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后4℃保存,禁止反复冻融,4℃保存1周。

3.试剂三:临用前加1.4ml蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,-20℃保存2周。

4.试剂四:临用前每支加1ml蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,-20℃保存2周。

5.工作液的配制:将试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:试剂五:试剂六按体积比=600:100:20:40:100:250混合,现用现配。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

3.血清等液体:直接检测。

二、测定步骤

1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.操作表:

试剂名称空白管测定管
样本(μL)
20
工作液(μL)180180
蒸馏水(μL)20-
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃(哺乳动物)水浴锅或者培养箱5min(酶标仪有控温功能的可将温度调至37℃),拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2,计算ΔA测定管= A2测定-A1测定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管(空白管只需做1-2次)。

三、UGP酶活计算

1.按微量玻璃比色皿进行计算:

(1)按照样本蛋白浓度计算酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟产生1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

UGP(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算酶活单位定义:每克组织每分钟产生1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

UGP(U/g质量)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算酶活单位定义:每104个细胞每分钟产生1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

UGP(U/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.643×ΔA

(4)按照液体体积计算酶活单位定义:每毫升液体每分钟产生1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

UGP(U/ml)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=321.54×ΔA

V反总:反应体系总体积,1×10-3L;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g ;500:细胞或细菌总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

2.按96孔UV板进行计算:

将计算公式中的d-1cm修改为d-0.6cm进行计算即可。

注意事项:

1.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。

2.A大于0.6或者A2测定大于1.5时,建议将样本稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时,可以延长反应时间(5min或10min)来测定。

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