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磷脂酶D(PLD)检测试剂盒(可见分光光度法)
包装:50管/48样


产品介绍

磷脂酶D(EC3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与胞脂质代谢、信号转导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱,胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质,在500nm处有特征吸收峰。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

提取液:液体50ml×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体55ml×1瓶,4℃避光保存。

试剂二:液体8ml×1瓶,4℃避光保存。

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加3ml无水乙醇醇充分溶解。

试剂四:液体35ml×1瓶,4℃避光保存。标准品:液体1ml×1支,4℃避光保存。

需自备的仪器和用品:

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、恒温水浴锅,无水乙醇。

操作步骤:

一、酶液提取

1.组织:按照质量(g):提取液体积(ml)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g,加入1ml提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃,100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500-1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞,功率300w,超声3s,间隔7s,总时间3min);然后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1ml试剂一。

3.血清:直接测定。

二、测定操作

试剂名称(ml)空白管标准管测定管
试剂一0.1

试剂二0.150.150.15
标准品
0.1
样品

0.1
试剂三0.050.050.05
充分混匀,30℃反应30min,沸水浴10min,打开盖子,自然冷却5min。
试剂四0.70.70.7
30℃反应30min,于1ml玻璃比色皿,空白管调零,测500nm处吸光值,分别记为A标准管和A测定管。

三、酶活计算公式

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/mg prot)= A测定管/A标准管×C标准÷Cpr÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/g)= A测定管/A标准管×C标准÷W÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/104cell)= A测定管/A标准管×C标准÷细胞数量÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)÷细胞数量

4.按照样本质量计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/ml)= A测定管/A标准管×C标准÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)

C标准:标准品浓度,500nmol/L; Cpr:样品蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量,g/ml;T:反应时间,30min。

注意事项:

1.试剂三置于-20℃保存,临用前配制,配置好的试剂三置于4℃保存不超过7天。

2.显色完成后,若有沉淀,于8000rpm,25℃离心5min后取上清测定。

3.吸光值不宜超过 1,否则用试剂一将酶液进行稀释,并在算公式中乘以稀释倍数。

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