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磷脂酶D(PLD)检测试剂盒(微量法)
包装:100管/96样


产品介绍

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

磷脂酶 D(EC 3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

磷脂酶 D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱,胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质,在 500nm处有特征吸收峰。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体 100ml×1瓶4℃
试剂一液体 102ml×1瓶4℃避光
试剂二液体 3ml×1瓶4℃避光
试剂三粉剂×1支-20℃避光
试剂四液体 15ml×1瓶4℃避光
标准品液体 1ml×1支4℃避光

溶液的配制:

1.试剂三:临用前加 1ml无水乙醇充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

需自备的仪器和用品:

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。

操作步骤:

一、酶液提取

1.组织:按照质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g,加入 1ml提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g离心 5min,取全部上清于 4℃、100000g离心 30min,弃上清,取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声  3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后于 4℃,10000g离心 5min,取全部上清于 4℃、100000g离心 30min,弃上清,取沉淀溶于 1ml试剂一。

3.血清:直接测定。

二、测定操作


空白管
标准管
测定管
试剂一(μL)
20

试剂二(μL)
303030
标准品(μL)

20
样品(μL)


20
试剂三(μL)
101010
分混匀,30℃反应 30min,沸水浴 1min,打开盖子,自然冷却 2min。
试剂四(μL)
140140140
30℃反应 30min,于微量石英比色皿/96孔板,空白管调零,测定 500nm处吸光值,分别记为 A标准管和 A测定管。

三、酶活计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/mg prot)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/g鲜重)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/104cell)= (A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/ml)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)

C标准:标准品浓度,500nmol/ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量,g/ml;T:反应时间,30min。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/mg prot)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/g鲜重)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/104 cell)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/ml)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)

C标准:标准品浓度,500nmol/ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量,g/ml;T:反应时间,30min。

注意事项:

1.显色完成后,若有沉淀,于8000rpm,25℃离心5min后取上清测定。

2.吸光值不宜超过1,否则用试剂一将酶液进行稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。

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