注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素 B₆(Vitamin B₆)又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。

测定原理

VB₆与 4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在 390nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 70mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体 1mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体 5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体 8mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 8mL×1瓶，4℃避光保存。

样本处理

1.组织：将样品磨碎，按照质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约0.1g，加入 0.6mL提取液)加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心 10min，取上清测定(动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟)。

2.细胞：按照细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议  500万细胞加入 0.6mL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。

3.血清：直接测定。

测定操作

计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

1.按照蛋白含量计算

VB₆含量(μg/mg prot)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷(V样×Cpr)= 13.76×(△A - 0.0205)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB₆含量(μg/g)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷(V样×W÷V样总)= 13.76×(△A - 0.0205)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB₆含量(μg/10⁴ cell)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)= 13.76×(△A - 0.0205)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB₆含量(μg/mL)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷V样= 13.76×(△A - 0.0205)

V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b．用 96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.1818x+0.0205，R² = 0.9986

1.按照蛋白含量计算

VB₆含量(μg/mg prot)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反总÷(V样×Cpr)= 27.52×(△A - 0.0205)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB₆含量(μg/g)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818 ×V反总÷(V样×W÷V样总)= 27.52×(△A - 0.0205)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB₆含量(μg/10⁴ cell)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)= 27.52×(△A - 0.0205)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB₆含量(μg/mL)=(△A - 0.0205)÷ 0.1818×V反总÷V样=27.52×(△A - 0.0205)

V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1.若测定结果中吸光值超过 1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。

3.显色完成后立即进行测定。