正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GCS(EC 2.4.1.11)催化 UDPG和葡萄糖残基生成糖原和 UTP，以 α-1，4-糖苷键相连延长糖链，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰岛素作用的主要靶酶，对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。

测定原理：

GCS催化 UDPG和葡萄糖残基生成糖原和 UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成 NAD+，在 340nm下测定 NADH下降速率，即可反映 GCS活性。需自备的仪器和用品：分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 18 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：液体 2.5mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体 16.4uL×1支，4℃保存；

试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；

样本的前处理：

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂五的配制：临用前在试剂五中加入 1mL试剂二充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、将工作液和试剂五置于 37℃预热 5分钟。

5、在 1mL微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、10μL试剂五和 180μL工作液，立即混匀，记录 340nm处初始吸光值 A1和 1min后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。注意：在该试剂盒中，若 ΔA大于 0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使 ΔA小于 0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

GCS活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=3215×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=6430×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。