正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1))是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开 α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放 1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子 α-1，6-糖苷键分支点前 4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶 a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶 b(GPb)两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸(5，-AMP)存在下可被激活。

测定原理：

GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP还原生成 NADPH，在 340nm下测定 NADPH上升速率，即可反映 GP活性。添加一定浓度的腺苷酸(5，-AMP)时测定 GP(GPa和 GPb)活性，未添加腺苷酸(5，-AMP)时测定 GPa活性，GP活性－GPa活性得到 GPb活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 40 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；

样本的前处理：

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零；

2、工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入 2.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入 2.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

5、试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入 1.25mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

6、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于 37℃预热 5分钟；

7、 1mL石英比色皿中加入 50μL样本、50μL试剂三、50μL试剂四、50μL蒸馏水和 800μL工作液，立即混匀，记录 340nm处 5min后的 A1和 10min后的吸光值  A2，计算 ΔAGPa=A2-A1。

8、在 1mL石英比色皿中加入 50μL样本、50μL试剂三、50μL试剂四、50μL试剂五和 800μL工作液，立即混匀，记录 340nm处 5min后的 A3和 10min后的吸光值 A4，计算ΔAGP=A4-A3。

注意：由于每个样本需要同时测一个 GP(GPa和 GPb)活性和一个 GPa活性，因此本试剂盒 50管测 24个样本。

GPb活性计算：

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb ( nmol/min/mg   prot ) ＝ [(ΔAGP － ΔAGPa)×V反总÷ ( ε×d ) ×10⁹]÷(V样 ×Cpr)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟产生 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb ( nmol/min/g鲜重 ) ＝ [(ΔAGP － ΔAGPa)×V反总÷ ( ε×d ) ×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。