正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

顺乌头酸酶(aconitase)，三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理

ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+还原生成 NADH，导致 340nm处光吸收上升。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1.5mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体 20mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：液体 5mL×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加 1.5mL 蒸馏水充分溶解；现配现用

试剂七：粉剂×1支，4°保存；临用前加 12mL 试剂四充分溶解；

工作液：临用前在 12mL 试剂七中加入 1mL 蒸馏水、1mL 试剂四、1mL 试剂五、1mL 试剂六充分混匀

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约 0.1g组织或收集 500万细胞，加入 1mL试剂一和 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆转入离心管内 600g，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。

5、在步骤④的沉淀中加入 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率 20%或200W，超声 3秒，间隔 10秒，重复 30次)，用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)将工作液，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。

(3)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 40μL样本 160μL工作液，混匀，立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 3min20s后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

ACO活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T=268×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=54×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.108×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=536×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=108×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.216×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。