顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒(紫外分光光度法)
产品介绍
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义 顺乌头酸酶(aconitase),三羧酸循环中的酶,催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化,在顺乌头酸酶作用下,通过脱水与加水反应,使羟基由β碳原子转移到α碳原子上,生成易于脱氢氧化的异柠檬酸,为进一步的氧化脱羧反应作准备。 测定原理 ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸,异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+还原生成 NADH,导致 340nm处光吸收上升。 需自备的仪器和用品 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制 试剂一:50mL×1瓶,-20℃保存; 试剂二:10mL×1瓶,-20℃保存; 试剂三:1mL×1支,-20℃保存; 试剂四:液体 60mL×1瓶,4℃保存; 试剂五:液体 5mL×1瓶,4℃保存; 试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加 3mL 蒸馏水充分溶解;现配现用 试剂七:粉剂×1支,4°保存;临用前加 36mL 试剂四充分溶解; 工作液:临用前在 36mL 试剂七中加入 3mL 蒸馏水、3mL 试剂四、3mL 试剂五、3mL 试剂六充分混匀 样本的前处理: 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离: 1、称取约 0.1g组织或收集 500万细胞,加入 1mL试剂一和 10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2、将匀浆转入离心管内 600g,4℃离心 5min。 3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。 4、上清液即胞浆提取物,可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。 5、在步骤④的沉淀中加入 200uL试剂二和 2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3秒,间隔 10秒,重复 30次),用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。 测定步骤 1、分光光度计预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。 2、样本测定 (1)将工作液,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min;现配现用;若分次用将工作液分装后于-20°保存,一星期内可用。 (3)在 1mL石英比色皿中加入 100μL样本 900μL工作液,混匀,立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 3min20s后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。 ACO活性计算 用石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按样本蛋白浓度计算 单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。 ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=536×ΔA÷Cpr (2)按样本鲜重计算 单位的定义:每 g组织每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。 ACO(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=108×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。 ACO活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.722×ΔA V反总:反应体系总体积,0.001 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。 |
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