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亮氨酸氨基肽酶(LAP)测试盒(微量法)
货号:LAP-1-Y
包装:100管/96样


产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

LAP是一类能水解肽链 N-末端为亮氨酸的酶,广泛存在于肝、肾、胰等组织中,尤其以肝脏中含量最为丰富。各类肝病患者因肝细胞损伤,血清 LAP的活性均有不同程度的升高,因此,血清 LAP活性的检测能从不同侧面反映各种肝病的发生和发展。

测定原理:

LAP分解 L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺,后者在 405nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算 LAP活性。

自备用品:

酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 15mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;

样本的前处理:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 1000~5000:1的比例(建议 2000万细菌或细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

LAP测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 405nm,蒸馏水调零。

2、将试剂二转移至试剂一中充分溶解(如较难溶解,可 50℃水浴加热约 30min促进溶解);在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min以上;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、在微量石英比色皿或 96孔板中加入 50μL样本和 150μL试剂一,混匀后立即记录 405nm处初始吸光值 A1和 2min后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

注意事项:若 ΔA大于 0.5,需将酶液用提取液稀释,计算公式中乘以相应稀释倍数。使A2-A1小于 0.5,可提高检测灵敏度。

LAP活力单位的计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)LAP活力的计算:

单位的定义:每 mL血清(浆)每分钟生成 1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=205.8×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 LAP活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=205.8×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=205.8×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.103×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:对硝基苯胺摩尔消光系数,9.72×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2  min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)LAP活力的计算:

单位的定义:每 mL血清(浆)每分钟生成 1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=411.5×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 LAP活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷ (V样×Cpr)÷T=411.5×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=411.5×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.206×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:对硝基苯胺摩尔消光系数,9.72×103 L/ mol/cm;d:

96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。

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