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海藻糖合成酶(TS)测试盒(微量法)
![]() 产品介绍
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: 海藻糖是功能性低聚糖,具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性,是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一,它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖合成酶(Trehalose Synthase)催化麦芽糖合成海藻糖,是海藻糖生物合成的关键途径之一。 测定原理: TS 催化麦芽糖产生海藻糖,使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖,通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量,按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合酶活性。 需自备的仪器和用品: 酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制: 提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 12mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:液体 12ml×1 瓶,4℃保存,充分混匀,如有沉淀,静置后取上层清液使用; 试剂三:液体 10ml×1 瓶,4℃避光保存; 试剂四:液体 10ml×1 瓶,4℃避光保存; 样品测定的准备: 1、细菌或细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复30 次);8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 2、组织的处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),冰浴中匀浆。8000g ,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 测定步骤 1、在 EP 管中加入如下试剂
混匀,40℃水浴反应 2h,95℃水浴 10 分钟终止反应,冷却至室温。
混匀,60℃过夜反应,10000g 25℃离心 10min,取上清待测。 2、工作液配制:临用前将试剂三和试剂四按照 1:1 的比例混合,用多少配多少。 3、在 96 孔板中加入如下试剂
混匀,室温反应 30min,于 505nm 下测定吸光值 A 对照与 A 测定,ΔA=A 对照-A 测定。 每个测定管设一个对照管。 TS 活力计算: 1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.3735x - 0.0014,R2 = 0.9999;x 为标准品浓度(μmol/mL),y 为吸光值。 2、按照蛋白浓度计算 单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 麦芽糖产生 1nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。 TS 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0014)÷0.3735×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000÷2=33.5×(ΔA+0.0014)÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol 麦芽糖产生 1nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。 TS 活力(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA+0.0014)÷0.3735×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000÷2=33.5×(ΔA+0.0014)÷W 4、按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 麦芽糖产生 1nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。 TS 活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0014)÷0.3735×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T×1000÷2=0.067×(ΔA+0.0014) V 样:加入样本体积:0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;V 反总:反应体系总体积, 0.3mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万; T:反应时间,120min;1000,μmol 到 nmol 转换系数;2,1 分子麦芽糖转化为 2 分子葡萄糖。 |
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