正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

DBE 能够专一性地裂解支链淀粉的α-1，6 糖苷键，产生线性的葡萄糖链，在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。

测定原理

采用 3，5-二硝基水杨酸法测定 DBE 催化支链淀粉产生的还原糖，通过测定还原糖含量的变化来计算 DBE 活性。

需自备的的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；临用前每支加入 6mL 试剂一，充分混匀后备用；用不完的试剂 4℃保存；

试剂三：液体 12mL×1 瓶，4℃保存； 试剂四：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 540 nm，蒸馏水调零。

2、加样表

混匀，37℃准确保温 2h

混匀，95℃水浴 5min，取 200uL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，540nm 处读取各管吸光值。

ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设个一个对照管。

注意：可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行 5min 95℃沸水浴处理。

DBE 活力单位的计算

标准条件测定回归方程为 y = 3.8458x - 0.165；x 为标准品浓度(mg/mL)，y 为吸光值。

(1)按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每 h 催化产生 1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

DBE 活力(mg/min/mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=0.26× (ΔA+0.165)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

DBE 活力(mg/min/g 鲜重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=0.26× (ΔA+0.165)÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2mL； V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

标准条件测定回归方程为 y = 1.9229x - 0.165；x 为标准品浓度(mg/mL)，y 为吸光值。

(1)按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每 h 催化产生 1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

DBE 活力(mg/min/mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=0.52× (ΔA+0.165)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

DBE 活力(mg/min/g 鲜重)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=0.52× (ΔA+0.165)÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2mL； V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。 标准曲线线性范围为 0.1mg/mL-1mg/mL。

ΔA 线性范围为 0.01-1。