位置:首页 > 产品中心
辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒(微量法)
货号:NADP-1-Y
包装:100管/48样


产品介绍

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+  )含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH,从而检测 NADP+含量。

所需的仪器和用品

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 支,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4 ℃保存一周;

试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周;

试剂四:粉剂×1 支,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周;

试剂五:液体 3.6mL×1 支,4 ℃保存;

试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NADP+和 NADPH 的提取

1、血清(浆)中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失); 冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和, 混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液), 超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液), 超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。

2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):

试剂名称(μL)对照管测定管
样本2020
试剂一8080
试剂二3030
试剂三3030
试剂四3030
试剂五3030
试剂六200混匀,室温避光静置 20min
试剂六
200

充分混匀,静置 5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七
400
400

混匀,取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若 NADP+测定中△A(A2-A1)≤0.0144NADPH 测定中△A(A2-A1)≤0.0259,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48 个 NADP+或 NADPH.

NADP+和 NADPH 含量的计算

(一)NADP+含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.0985x + 0.0144,R2 = 0.9998;其中 y 为△A,x 为 NADP+浓度 nmol/mL

1、血清(浆)中 NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144)

2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP+ (nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADP+ (nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0144)÷0.0985×V1)]÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144)

(二)NADPH 含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.6198x + 0.0259,R2  = 0.9977;其中 y 为△A,x 为 NADPH浓度 nmol/mL

1、血清(浆)中 NADPH 含量计算

NADPH 含量(nmol/mL)= [(△A -0.0259)÷0.6198×V1)]÷(V3×V1÷V2)= 32.3×(△A -0.0259)

2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷0.6198×V1)]÷(V1×Cpr)= 1.6×(△A -0.0259)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g  鲜重)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2×(△A -0.0259)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/104 cell)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006×(△A -0.0259)

V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆) 体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

注意:最低检测限为 0.01nmol/mL 0.01nmol/g 鲜重或 0.001nmol/mg prot

广州伟伯科技有限公司
手机: 13533759269
联系人: 林生
相关产品:
| 首页 | 联系我们 | 会员服务 | 广告服务 | 友情链接 |
版权所有 CopyRight © 2008-2024 粤ICP备08119708号