正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

吡咯啉-5-羧酸还原酶( P5CRs)  是普遍存在于原核和真核生物中的一类重要的管家蛋白。其主要功能是催化脯氨酸生物合成的最后一步反应，将吡咯啉-5-羧酸( P5C) 转化为脯氨酸， 在调节细胞凋亡等一系列病理和生理过程中起着重要作用。

测定原理：

P5CR 具有噻唑烷-4-羧酸脱氢酶活性，催化噻唑烷-4-羧酸的脱氢反应，同时将 NAD 转化为NADH，使 WST-8 变成橙黄色，测定 450nm 下吸光值增加速率来反映酶的活性。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：液体 1.5mL×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)；12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液)，进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm。

2、 样本测定

(1)临用前在试剂二中加入 12mL 试剂一，试剂三中加入 6mL 试剂一，充分溶解混匀，用不完的试剂分装后-20℃保存；

(2)工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液

(3)按下表在 96 孔板中加入如下试剂

37℃避光孵育 30min，450nm 下测定吸光值 A 测定与 A 对照，△A=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

标准条件下测定回归方程为 y = 0.6692x - 0.0285，R2 = 0.999； x 为 NADH 含量(μmol/mL)，y 为吸光值。

1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/mg prot)= (△A+0.0285)÷ 0.6692×V 样÷(V 样×Cpr)×1000÷T=49.8×(△A+0.0285)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/g  鲜重)= (△A+0.0285)÷ 0.6692×V 样÷(W ×V 样÷V 样总)×1000÷T=49.8×(△A+0.0285)÷Cpr

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/10⁴ cell)= (△A+0.0285)÷ 0.6692×V 样÷(500×V 样÷V 样总)×1000÷T=0.0996×(△A+0.0285)

V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；1000，μmol 到 nmol 的换算系数。