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吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)测试盒(可见分光光度法)
货号:P5CS-2-Y
包装:50管/24样


产品介绍

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同,分为谷氨酸( Glu)  和鸟氨酸( Orn)  两条合成途径。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS, Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)是以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理:

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 过程中分解 ATP 生成 ADP 和无机磷,通过钼酸铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定 P5CS 活性。

需自备的仪器和用品:

可见外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 60 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 6 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂三:液体 6 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存,用时加入 25 mL 蒸馏水,溶解后 4℃保存一周;

试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存,用时加入 25 mL 蒸馏水,溶解后 4℃保存一周;

试剂六:液体 25mL×1 瓶,室温保存;

试剂七:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂七 20 倍稀释,即取 0.1mL 试剂七加 1.9mL 蒸馏水充分混匀。

定磷剂的配制:按 H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1  的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

注意:配试剂**用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

样品酶液的制备:

1、组织样品:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

操作步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 660nm。

2、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂)


对照管测定管
试剂二(μL)
100
样本(μL)
100

混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)准确水浴 10min

试剂三(μL)100100
试剂二(μL)100
样本(μL)100

混匀,8000g,25℃离心 10min,取上清液

3、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)


空白管

标准管对照管测定管
0.5μmol/ml 标准磷应用液(μL)
100

上清液(μL)

100100
蒸馏水(μL)100


定磷试剂(μL)1000100010001000

混匀,室温放置 30min,在  660nm 处,记录各管吸光值。

注意:

1、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒 50 管保证测 24 份 P5CS 活性。

2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。

3、空白管和标准管只要做一管。每个测定管设一个对照管。

计算

1、血清(浆)P5CS 活力的计算:

单位定义:每小时每毫升血清(浆)中 P5CS 消耗 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

P5CS 活力(μmol/h/mL)=C 标准管×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 总÷V 样÷T=9 ×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

2、组织中 P5CS 活力的计算:

(1)按蛋白浓度计算:

单位定义:每小时每毫克组织蛋白中 P5CS 消耗 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

P5CS 活力(μmol/h/mg prot)=C 标准管×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V总÷(Cpr×V 样)÷T =9 ×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位定义:每小时每克组织中 P5CS 消耗 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

P5CS 活力(μmol/h  /g  鲜重)=C 标准管×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=9 ×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W

C 标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V 总:酶促反应总体积,0.3mL;V 样:加入样本体积,0.1mL ;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1/6 小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。

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