产品说明
一般描述
CRISPR Cas9-D10A切口酶表达质粒使用CMV启动子，可获得较强的Cas9瞬时表达。您可以使用MluI和NheI酶切将CMV替换为其它启动子。同时，使用XbaI酶切可使Cas9-D10A表达质粒线性化，得到基于T7的mRNA产物。
应用
功能性基因组学/靶点验证
- 在多种细胞系中进行基因敲除
- 对不适合于RNAi的基因进行完全敲除
- 建立基因敲入细胞系，将启动子、融合标签或报告基因整合到内源性基因中
特点和优势
Cas9-D10A单个载体的应用可延伸至所有U6-向导RNA质粒。为优化Cas9与向导RNA的比例，可改变Cas9和向导RNA的用量。最新证据表明，CRISPR内切酶的脱靶效应是一个重要问题。为了解决这一问题，Sigma开发的配对切口酶技术可将CRISPR DNA识别域的长度延长至与ZFN和TALEN相近。我们的经验表明，基于Cas9-D10A突变体的配对切口酶是最可靠的。我们的开发工作也证明，产生活性配对切口酶的关键因素在于gRNA在5′至5′方向上的定位。对于配对CRISPR切口酶质粒的递送，我们建议使用由Cas9-D10A 表达载体和2个U6驱动型gRNA组成的三元系统。为了简化配对切口酶的使用，可通过Sigma的在线工具进入预设计配对切口酶库。请查看Sigma在线CRISPR产品，获取最新设计方案集。
组分
1管含1μg 的Cas9-D10A 切口酶质粒。
请注意，该产品不含向导RNA序列。向导RNA必须通过定制CRISPR产品选项卡单独购买。
原理
CRISPR/Cas是细菌和古细菌的一种防御系统，可用来对抗入侵的病毒和质粒。来自酿脓链球菌的II型CRISPR/Cas系统包含两种分子元件，即一个Cas9蛋白和一个非编码向导RNA(gRNA)，该系统经过基因改造而被用于真核系统中。Cas9核酸内切酶可在单个gRNA的引导下，在指定基因组位置上引入DNA双链断裂(DSB)。与锌指核酸酶(ZFN)诱导的DSB相似，细胞随后会激活内源性DNA修复程序，即非同源性末端接合(NHEJ)或同源重组修复机制(HDR)，对目标DSB进行修复。
外形
Sigma Cas9-D10A切口酶质粒的产品形式是浓度为20ng/μl的50µl溶液。
制备说明
Sigma CRISPR质粒产品为小量提取包装，可能不适用于转染到特殊类型的细胞中。为得到最佳结果，我们建议在转染前使用无内毒素的DNA纯化试剂盒大量提取质粒。
其他说明
为了介导DNA位点特异性双链断裂，必须与两条U6-gRNA质粒一起使用。
文献中使用的标准转染浓度范围为≥1.0 ug/μl且≤5 uL的Cas9-D10A 质粒结合≥1.0 ug/μl且≤5 ul的U6-gRNA质粒。(上述所有浓度均假设是对0.5~1百万个细胞进行核转染)
法律信息
CRISPR使用许可协议
基本信息
| NACRES | NA.51 |
产品性质
| 质量水平 | 200 |
| 重组 | expressed in E. coli |
| 包装 | vial of 50 μL |
| 浓度 | 20 ng/μL in TE buffer; DNA (1μg of plasmid DNA) |
| 启动子 | Promoter name: CMV |
| application(s) | CRISPR |
| selection | kanamycin |
| 运输 | dry ice |
| 储存温度 | −20℃ |
安全信息
| 储存分类代码 | 12 - Non Combustible Liquids |
| WGK | WGK 1 |
| 闪点(F) | Not applicable |
| 闪点(C) | Not applicable |
