基本信息
分子式 | C17H13ClN4 |
分子量 | 308.76 |
存储条件 | Freezer -20℃ |
产品描述
JIB-04是一种广谱的选择性Jumonji histone demethylase抑制剂,无细胞试验中对JARID1A,JMJD2E,JMJD3,JMJD2A,JMJD2B,JMJD2C和JMJD2D的IC50分别是230 nM,340 nM,855 nM,445 nM,435 nM,1100 nM和290 nM。
靶点(IC50 & Targe)
JARID1A,230nM
JMJD2A,445nM
JMJD2B,435nM
JMJD2D,290nM
JMJD2E,340nM
体外研究
JIB-04 以癌症选择性的方式引起转录改变,包括下调增殖基因,上调抗增殖/前凋亡基因。JIB-04能够以IC50低至10 nM的水平阻碍肺癌、前列腺癌细胞系的增殖,同时在HBECs和PrSCs/PrECs中产生较少的抗增殖活性。[1]
体内研究
在两个小鼠异种移植模型(H358或A549)中,JIB-04减少肿瘤生长,降低肿瘤中Jumonji组蛋白脱甲基酶的活性,延长肿瘤患者生存时间。[1]
激酶实验
Jumonji脱甲基酶/脯氨酰羟化酶/LSD1活性检测:
活性JMJD2E氨基酸1-350从E.coli中纯化,体外环境中与α-酮戊二酸,5-10 μM铁离子,抗坏血酸,组蛋白肽段基质一起使用,偶联反应时加入甲醛脱氢酶和NAD+来定量NADH的生成量,或使用Epigentek kit P-3081。组蛋白脱甲基反应结果通过Western分析来定量,构建His-tagged hJMJ2D氨基酸1-350表达体系,E.coli表达产物通过Qiagen Ni-NTA琼脂糖手册进行纯化。蛋白用50 mM TrisHCl pH 7.8+0.3 M NaCl + 10%甘油+200 mM immidazol洗脱,后用20 mM TrisHCl pH 7.4,0.15 M NaCl,0.2 mM PMSF,0.5 mM DTT,8%甘油透析。蛋白分装,速冻、储存在-80°C。Western blot中,~1.5 μg酶与0.3 μg H3K9me3基质(Active Motif #31213),10 μM (NH4)2Fe(SO4)2,1 mM α-酮戊二酸,2 mM L-抗坏血酸钠在50 mM pH 7.9溶液中混合,与溶媒或药物在37°C孵育30min-2hrs。加入SDS loading buffer后,煮沸,样品在NuPage 4-12% Bis-Tris胶上电泳,转膜,用Upstate #07-523处理硝化纤维素膜以检测H3K9me3。H3总信号是通过Active Motif #39763和连接IRDye 680的驴抗兔IgG(二抗, LI-COR # 926-32223),在Odyssey Infrared成像系统中获取图像。体外IC50检测和竞争性试验,100-200 ng纯化蛋白与溶媒、JIB-04或类似物共孵育,通过ELISA(H3K9me3去甲基作用:Epigentek kit P-3081,H3K4me3去甲基作用:P-3083,H3K27me3去甲基作用:P-3085)检测活性,反应液包含50mM Hepes pH 7.5,0.01% Tween 20,120nM (NH4)2Fe(SO4)2,1 mMα-酮戊二酸,2 mM L-抗坏血酸钠,50ng肽段基质。最终酶浓度分别为:206 nM JMJD2A,12 nM JMJD2B,60 nM JMJD2C,90 nM JMJD2D E.coli,30 nM JMJD2D Sf9,30 nM JMJD2E,30 nM Jarid1a,35 nM JMJD3。E.coli表达的hJMJD2A(氨基酸1-350)纯化后以每孔400 ng的量进行检测。通过GraphPad Prism软件计算IC50和进行曲线拟合。需要注意的是在基质竞争性试验中, 应该使分析处于线性范围并且不超出ELISA板的结合能力。细胞裂解物的H3K9me3脱甲基酶活性的直接测定:超声处理细胞(细胞接种浓度为2x10E+06/10cm板)或肿瘤PBS匀浆(3x4 sec),等量的蛋白与组蛋白H3K9me3基质在反应液中37°C孵育2h后,用Epigentek kit P-3081进行免疫检测。500 ng E.coli表达的PHD2纯化蛋白,溶于40mM Tris pH 7.4,100mM NaCl,20% glycerol,5mM β-mercapto-ethanol,10mM 麦芽糖备用。从HIF-1 ODD分离出的生物素化的肽段固定在亲和素包裹的96孔板中。酶与被试药物在反应液(20 mM Tris-Cl pH 7.5,5 mM KCl,1.5 mM MgCl2,2 mM DTT,0.12 μM硫酸亚铁,0.5 mM戊邻酮二酸盐,1 mM抗坏血酸)中室温孵育45min。α-酮戊二酸的竞争性类似物DMOG作为抑制作用的阳性对照。肽段羟基化是通过对羟基化HIF肽表位使用多克隆兔抗体,再加入连接羊抗兔HPR的二抗。EnVision上读取发光值。LSD1重组蛋白活性通过使用Epigentek kit P-3075检测。
细胞实验
Cell lines: 人肺癌细胞系(LCa),原代或非致癌细胞系HBECs,前列腺癌(PCa),原代前列腺基质细胞(PrSC)和前列腺上皮细胞(PrEC)。
Concentrations: ~10 μM
Incubation Time: 96小时
Method:以每孔1500-3000细胞接种至96孔板,次日开始以递增浓度的化合物处理细胞4天后,用MTS标准分析法用Promega’s Cell Titer或Cell Titer-Glo试剂测试细胞活性,使用Spectra Max或FlouroStar Omega酶标仪读取490 nm和650 nm的吸光度。每种细胞系进行2-5次独立测试,每次包含4-8个测试孔。IC50 通过DIVISA软件计算得到。
(Only for Reference)
动物实验
Animal Models: H358或A549小鼠异种移植模型
Formulation: 12.5%聚氧乙烯蓖麻油,12.5% DMSO水性悬液(A549,灌胃),10% DMSO 90%芝麻油(H358,腹腔注射)
Dosages: 110 mg/kg (H358,腹腔注射),55 mg/kg (A549, 灌胃)
Administration: 灌胃或腹腔注射
(Only for Reference)
参考文献
[1] Wang L, et al. Nat Commun. 2013, 4, 2035.
安全信息
图形或危害标志 | |
危险说明 | H302 H410 |
防范说明 | P264 P270 P273 P301+P312 P330 P391 P501 |
UN号码 | 3077 |
危险分类 | 9 |
包装等级 | III |