产品及特点

牛棒状杆菌病 (Bovine  Corynebacteriosis)是指由棒状杆菌属 (Corynebacteriumspp.)的某些细菌引起的膀胱炎和肾盂肾炎。临床主要特征为频尿、浊尿、血尿和发热。该病主要见于成年母牛，多在妊娠期和产后发病。本病分布于世界各地。本产品就是以染料法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测牛棒杆菌的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、特异性高，引物是根据牛棒杆菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。

3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR高 100倍。

4、提供无传染性的 PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。

5、一管式操作，荧光 PCR检测，不容易产生环境污染。

6、本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50次 20μL体系的 PCR。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、制备标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL阳性对照(其浓度为 1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8、如果有 N个样品，则需要进行 N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 20次免 DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为 PCR模板，省略了 DNA提取步骤。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果进行定量分析，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6个标准曲线样品只选一个做(可以选 4号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。

10、在标记管中按下表加入各成分：

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000 、 RotorGene 6000和 LightCycler480 )不需要使用 ROX，则用水替代。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

四、荧光定量 PCR反应参数

五、数据处理

12、设定 60℃-96℃范围的熔解曲线分析，排除假阳性。

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。