产品及特点

沃尔巴克氏菌(Wolbachia spp.)为革兰氏阴性菌，又称为沃尔巴克氏体，属于变形菌纲 Proteobacteria的 α亚门，立克次氏体科乌巴克体族乌巴克体属中的一种，1924年由 Hertig和 Wolbach在尖音库蚊 Culexpipiens的生殖组织里**被发现。沃尔巴克氏菌是自然界分布最为广泛的一种共生菌，在鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目、直翅目和啮目等 10多个目的 150万一 500万种昆虫中都有共生。沃尔巴克氏菌感染昆虫和其它节肢动物后，会导致昆虫和其他节肢动物无法产生雄性后代。21世纪初，对沃尔巴克氏菌的研究成为热点。科学家们在积极寻找控制沃尔巴克氏菌的新方法或开发消灭沃尔巴克氏菌的新药物，原因在于一旦控制或消灭沃尔巴克氏菌则有可能消除或抑制病原性宿主对人类、禽畜和作物造成的伤害。因此快速检测沃尔巴克氏菌具有重要意义。荧光定量 PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测沃尔巴克氏菌的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、特异性高，引物是根据人沃尔巴克氏菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌和微生物。

3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR高 100倍。

4、提供无传染性的 PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。

5、一管式操作，荧光 PCR检测，不容易产生环境污染。

6、本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50次 20uL体系的 PCR。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的标准曲线样品的第 4号(浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 1万拷贝)或第 5号(浓度为 1×10⁵拷贝/μL，10μL相当于 10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为  PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL样品，则 PC和 NC的体积也必须是 200μL。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌 DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌 DNAout或柱式细菌 DNAout。本试剂盒免费赠送 50次免 DNA提取的 DNA释放剂。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做 2-3次重复，则反应设置数量相应增加 2或 3倍。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene  3000、RotorGene  6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

四、荧光定量 PCR反应参数

五、数据处理

12、以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

五、电泳检测

13、如果有必要电泳确认，可取 10-20  uL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为 400 bp。