产品及特点

艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌，一般寄生在人的肠道内。如果过度服用某些抗生素，艰难梭菌的菌群生长速度加快，影响肠道中其他细菌，引发炎症。该细菌会引起伪膜性肠炎，临床表现为腹泻、腹痛、伴有全身中毒症状，症状突然开始，并伴随血压低，严重时能致死。通常还伴有发烧，白细胞增多，之后可导致死亡，是很严重的一类疾病。该细菌还会引起抗生素相关性腹泻，在体内的潜伏期为5-10天，之后导致大量的棕色或水状腹泻，持续1周左右。除上述疾病外，艰难梭菌尚可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等。近年来该菌已成为医院内感染的病原菌之一，日益被人们所重视，因此快速检测艰难梭状芽孢杆菌具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测艰难梭状芽孢杆菌的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据人艰难梭状芽孢杆菌高度保守的VP1区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5、本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

6、本产品只能用于科研。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在7号管中加入5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品，**设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌DNAout或柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送50次免DNA提取的DNA释放剂，本产品的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

五、数据处理

12、以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

六、电泳检测

13、如果有必要电泳确认，可取10-20μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。