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线粒体呼吸链复合体V,ATP合酶,三磷酸腺苷合酶测试盒(微量法)
![]() 产品介绍
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: 线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素 C氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞色素 C的氧化,并最终把电子传递给氧,生成水。 测定原理: 还原型细胞色素 C在 550nm有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素 C生成氧化型细胞色素 C,因此 550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制: 试剂一:液体 100ml×1瓶,-20℃保存; 试剂二:液体 20ml×1瓶,-20℃保存; 试剂三:液体 1.5ml×1瓶,-20℃保存; 试剂四:液体 20ml×1瓶,4℃保存; 试剂五:粉剂×1支,-20℃保存; 试剂六:粉剂×1支,-20℃保存; 样本的前处理: 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离: 1、准确称取 0.1g组织或收集 500万细胞,加入 1ml试剂一和 10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2、将匀浆 600g,4℃离心 5min。 3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心 10min。 4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。 5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 200uL试剂二和 2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10秒,重复 30次),用于复合体Ⅳ酶活性测定。 测定步骤: 1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 550nm,蒸馏水调零。 2、样本测定 (1)工作液的配制:临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 (2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 20μL样本和 200μL工作液,混匀,记录 550nm处初始吸光值 A1和 37℃反应 30min后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。 注意点:若 ΔA大于 0.2,需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数),使 A1-A2小于 0.2,可提高检测灵敏度。 复合体Ⅳ活力单位的计算: a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下: (1)按样本蛋白浓度计算 单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=19.20×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 (2)按样本鲜重计算 单位的定义:每 g组织每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。 复合体 Ⅳ活力 (nmol/min/g鲜重 )=[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=3.88×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.008×ΔA V反总:反应体系总体积,2.2×10-4 L;ε:细胞色素 C摩尔消光系数,1.91×104 L/ mol/cm; d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02 ml;V样总:加入提取液体积,0.202 ml; T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。 b.使用 96孔板测定的计算公式如下: (1)按样本蛋白浓度计算 单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=38.39×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 (2)按样本鲜重计算 单位的定义:每 g组织每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。 复合体 Ⅳ活力 (nmol/min/g鲜重 )=[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=7.76×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.016×ΔA V反总:反应体系总体积,2.2×10-4 L;ε:细胞色素 C摩尔消光系数,1.91×104 L/ mol/cm; d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02 ml;V样总:加入提取液体积,0.202 ml;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。 |
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