正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素 C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素 C的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。

测定原理：

还原型细胞色素 C在 550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素 C生成氧化型细胞色素 C，因此 550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体 100ml×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20ml×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1.5ml×1瓶，-20℃保存；

试剂四：液体 20ml×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取 0.1g组织或收集 500万细胞，加入 1ml试剂一和 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心 10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超声  3s，间隔  10秒，重复 30次)，用于复合体Ⅳ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

(2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 20μL样本和 200μL工作液，混匀，记录 550nm处初始吸光值 A₁和 37℃反应 30min后的吸光值 A₂，计算 ΔA=A₁-A₂。

注意点：若 ΔA大于 0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数)，使 A₁-A₂小于 0.2，可提高检测灵敏度。

复合体Ⅳ活力单位的计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=19.20×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

复合体 Ⅳ活力 (nmol/min/g鲜重 )=[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=3.88×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.008×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.2×10^-4 L；ε：细胞色素 C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/ mol/cm； d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml； T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=38.39×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

复合体 Ⅳ活力 (nmol/min/g鲜重 )=[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=7.76×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.016×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.2×10^-4 L；ε：细胞色素 C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/ mol/cm； d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，30  min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。