意义：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种参与多种氧化还原反应的酶辅因子(辅酶Ⅰ)。NAD 作 为电子载体，在氧化态(NAD)和还原态(NADH)之间循环。除了在氧化还原反应中的作用外，NAD 在 ADP 核糖基化反应中起着关键作用，并且是 sirtuins 的底物。辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生 物和培养细胞中。NAD 参与细胞物质代谢、能量合成、细胞 DNA 修复等多种生理活动，对机体免疫能力 有重要作用。NADH 在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说 明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。

原理：分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原 氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一 步采用 MTT 还原法检测，通过吸光值变化即可定量检测辅酶ⅠNAD (H)的含量。

检测方法：分光光度法

产品组成及保存条件：

※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

1. 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取：

(1)NAD+的提取：按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 酸性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)； 冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和， 混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

(2)NADH 的提取：按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建 议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 碱性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)； 冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和， 混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织中 NAD+和 NADH 的提取：

(1)NAD+ 的提取：按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建议取约0.1g 组织，加入 1mL 酸性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴 中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

(2)NADH 的提取：按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5～10 的比例(建议取约0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴 中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3. 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：

(1)NAD+ 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：酸 性 提取液体积(mL)为 500～1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液)， 超声波破碎 1min(冰浴，强度 20%或 200W，超声 2s，停 1s)，95℃水浴 5min(盖紧，以防 止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取 液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

(2)NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：碱 性提取液体积(mL)为 500～1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液)， 超声波破碎 1min(冰浴，强度 20%或 200W，超声 2s，停 1s)，95℃水浴 5min(盖紧，以防 止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取 液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2. 在1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加入下列试剂

注意事项：

1. 对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完 AK300-A、B、C、D、E 后必须马上加 AK300-F；测定管加完 AK300-A、B、C、D、E 后必须反应 20min 后再加 AK300-F。

2. 操作及反应过程中注意避光。

3. 由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50 管保证测 24 个 NAD+ 或 NADH。

(一) NAD+含量的计算：

1. 血清(浆)中 NAD+含量计算

NAD+含量 (nmol/mL) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷V 血清=25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1

2. 组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD+ (nmol/mg prot) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷(V 提取×Cpr)= 2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 ÷ Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD+ (nmol/g 鲜重) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷W= 2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NAD+ (nmol/10⁴ cell) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取×2÷500=0.005×ΔA 测定÷ΔA 标准 1

(二) NADH 含量的计算：

1. 血清(浆)中 NADH 含量计算

NADH 含量 (nmol/mL) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷V 血清=25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

2. 组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷(V 提取×Cpr)= 2.5×ΔA 测定÷ΔA

标准 2 ÷ Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重) = ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷W=2.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/10⁴ cell) =ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取×2÷500=0.005×ΔA 测定÷ΔA 标准 2

注：C 标：NAD 或 NADH 标准溶液的浓度 1.25nmol/mL；V 提取：加入提取液总体积，1mL；2：提取过程中上清液稀释倍数； V 血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：500 万个细胞。