PKH26荧光细胞连接试剂盒采用拥有专利的膜标记技术，专利膜标记技术，稳定的与细胞膜脂质区结合并发出红色荧光，染色方式依赖于细胞与膜的类型，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究及体内外细胞示示踪研究。

注意事项和免责说明

该产品仅用于科研，不用于制药、家庭或其它用途。请遵照安全数据清单中关于有害及安全操作规范操作。

储存/稳定性

PKH26乙醇溶液冷藏保存。保证染料乙醇溶液瓶盖盖紧减少蒸发以防止染料浓度升高。该染料避光保存，使用前观察是否有结晶。如出现结晶，室温防止30min，然后超声或震荡直至溶解。

稀释液C可室温或冷藏保存。如果冷藏保存，使用前复温至室温。稀释液C为无菌溶液，不含任何防腐剂和抗生素，其需保持无菌。不要将染料储存于稀释液C中。溶于稀释液C的工作液需现配现用，且配好后需立即使用。

一般细胞膜标记操作过程

亲脂性染料结合到细胞膜上完成标记。染色强度是染料浓度和细胞浓度的函数，与渗透性无关。因此，保证染料添加量不过量非常关键。过标记的细胞将会导致细胞膜完整性缺失或降低细胞活性。

下列过程可用于体内体外细胞的标记，包括干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、神经细胞或者任何其他细胞。体内细胞的标记过程需一定的改进，如血小板的染色，或者选择性标记吞噬细胞。

下述染色过程中细胞浓度和染料浓度代表操作的起始浓度。该浓度被证明适用于多种细胞。使用者需通过评估染色后细胞活率(如，PI染色)、荧光强度、染色均匀度及是否对所研究细胞功能有影响等，根据实验目的，确定最优的染料浓度和细胞浓度。

注意1：PKH26染色过程中，不能存在叠氮化物或代谢毒性物。

注意2：虽然贴壁细胞也可以染色，但单个悬浮细胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶(trypsin/EDTA)将贴壁细胞消化成单个悬浮细胞后再染色效果更佳。

下列过程最终体积为2mL，PKH26浓度为2×10-6M，细胞浓度为1×107cells/mL。

以下过程均在室温下进行(20-25℃)

1. 将2×107个细胞于离心管中，用不含血清培养基洗一遍。

注意：血清蛋白和脂质会与染料结合，降低与细胞膜结合的染料浓度。最好在用稀释液C重悬细胞染色前(第四步)用无血清培养基或缓冲液洗细胞一次(第×步)。

2. 400×g离心5分钟。

注意：PKH26染料不能直接加到离心沉淀中，这样会造成细胞染色不均一和细胞活力降低。

3. 离心后，小心吸弃上层清液，剩余上层细 胞液体积不超过25μL。

注意：为得到可重复的实验结果，在用稀释液C重悬时，减少残留培养基或缓冲液体积非常重要。见参考文献9的注意28。

4. 加入1mL稀释液C用移液管轻轻吹打混匀，制备 2×细胞悬液。不要用振荡器震荡，不要让 细胞在稀释液C中保存太长时间。

注意：生理盐(physiologic salts)的存在会使得染料结团并大幅降低染色效率。因此，需确保染色时细胞悬浮于稀释液C中，不含培养基或缓冲盐。

5. 临染色之前，将4μL PKH26乙醇溶液加 入1mL稀释液C中，充分混匀，配制的 2×染色液(4×10-6M)。

注意1：为减少乙醇对细胞活率的影响，步骤5加入的染料使得步骤6中乙醇最终浓度不能超过1-2%。

注意2：如果所需染料最终浓度＜2×10-6M，需用100%乙醇将PKH26稀释于另一单独的容器中，以确保实验结果的可重复性。

6. 快速将1mL 2×细胞悬液(步骤4)加入 1mL 2×染色液(步骤5)中，立即用移液 管混匀。最终细胞浓度为1×107/mL，

PKH26浓度为2×10-6M。

注意：由于染色瞬间完成，快速将细胞与染料混匀对得到明亮、均匀和可重复的标记结果非常重要。下列措施有助于得到较优的结果：

a.不要将PKH26染料直接加入含2×细胞的稀释液C中。

b. 将2×细胞悬液(步骤4)与2×染色液(步骤5)等体积混合。

c. 调整2×细胞和2×染料的浓度避免染色 体积太小(＜100μL)或太大(＞5mL)。

d. 用电动移液器快速将细胞和染料混匀。 血清移液管混匀速度太慢而使得染色不 均匀。Racking和旋涡震荡混匀同样混匀 较慢，染色均一性较差。

e. 分配体积尽量准确，以保证样品与样品 之间，实验与实验之间的可重复性。

7. 混匀后的染色的细胞孵育1-5 min。由于 染色速度较快，延长孵育时间对实验没有帮助。

注意：让细胞在染色液中停留尽量短的时间，同时保证得到理想的染色强度。因为稀释液C缺少生理性盐，过长时间的暴露在稀释液C中会造成某些细胞活力降低。如果不能确定其影响程度，可增加仅作稀释的对照组和只用乙醇而不用染料染色的对照组。

8. 加入等体积的血清(2mL)或其它合适的蛋白溶液(如1% BSA)终止反应，孵育1min以结合多余的染料。

注意1：血清(或等效的蛋白浓度)为最优的终止液。如果用完全培养基替代，添加体积为10mL。

注意2：不要通过加稀释液C或离心来终止反应。

注意3：不要用无血清培养基或缓冲盐，他们会使染料产生聚集。染料聚集使清洗过程中无法洗净，使得分析过程中仍存在未标记的细胞。

9. 将细胞在20-25℃条件下400×g离心10min，小心吸弃上清。用10mL完全培养基重悬，将重悬液转移至另一新的无菌离 心管中，20-25℃条件下400×g离心5 min。用10mL完全培养基再清洗两遍以除去没 结合的染料。

注意1：将重悬液转移至新离心管中，减少了离心管壁残留的染料对洗涤效率的影响；

注意2：不要用稀释液C清洗。

10. 最后一步清洗后，用10mL完全培养基重悬细胞评估细胞回收率，细胞活率和荧 光强度(图2。离心重悬细胞至所需活细 胞浓度。

注意1：染色后的细胞可以用中性甲醛固定，避光条件下，荧光强度至少3周内保持稳定。

注意2：染色荧光强度一般为背景的100-1000倍。虽然染色的CV值与细胞种类有关，但荧光分布应该尽量均匀对称。

图2. PKH26染色优化

MC-38 TIL细胞用上述指定PKH26浓度染色，最终细胞浓度为1×107/ml。活力(▲)由FITC染色测定，平均荧光强度(●)用流式细胞仪检测。用20μM PKH26标记后，抗肿瘤TIL特异性和效能没有改变。