限制性内切酶LpnPI

• 在 rCutSmart^™ 缓冲液中具有 100% 活性（超过 210 种内切酶兼容于此缓冲液），便于进行双酶切
• 特异性识别表观遗传相关的 DNA 修饰（5-mC 和 5-hmC）
• 限制性内切酶酶切位点：CCDG(10/14)

LpnPI 已经过 EpiMark^® 验证，是一种修饰依赖的内切酶，可以识别 C^mCDG 位点并在修饰化胞嘧啶的 3´ 端 N₁₀/N₁₄ 处切割双链 DNA。识别位点的胞嘧啶修饰包括 C5-甲基化（5-mC）和 C5-羟甲基化（5-hmC）（1）。
本酶配有酶激活溶液，可用于辅助 LpnPI 高效酶切。
在真核生物中最常见的表观遗传学修饰为 CpG 或 CHG 位点处的甲基化标记。这些修饰位点中有一部分可被 LpnPI 识别并酶切。
在完全甲基化的 CpG 位点处：
5´ . . . C ^mC G G . . . 3´
3´ . . . G G ^mC C . . . 5´
或 CHG 位点：
5´ . . . C^mC D G G . . . 3´
3´ . . . G G H ^mC C . . . 5´
H = A 或 C 或 T（非 G）
D = A 或 G 或 T（非 G）
LpnPI 单独识别每个半甲基化位点，并进行双向酶切，产生 32 碱基或 31 碱基的片段。这些片段包含中间的甲基化位点，并在各个末端含有 4 碱基 5´ 突出末端。LpnPI 不会酶切未经修饰的 DNA。

产品来源

大肠杆菌菌株，携有克隆自嗜肺军团菌属（Legionella pneumophila）Philadelphia 1 的 LpnPI 基因。

• 特性和用法

  单位定义

  一个单位是指在 50 µl 的总反应体系中，37℃ 下，1 小时内酶切 1 µg pBR322（dcm⁺）DNA 所需的酶量。

  反应条件

  1X rCutSmart™ 缓冲液
  Supplement with 1X 酶活化剂溶液
  Incubate at 37℃

  1X rCutSmart™ 缓冲液
  50 mM Potassium Acetate
  20 mM Tris-acetate
  10 mM Magnesium Acetate
  100 µg/ml Recombinant Albumin
  (pH 7.9 @ 25℃)

  使用浓度

  4,000 units/ml

  在不同缓冲液中的活性

  NEBuffer™ r1.1: <10%
  NEBuffer™ r2.1: <10%
  NEBuffer™ r3.1: <10%
  rCutSmart™ Buffer: 100%

  稀释兼容性

  • 稀释液 B

  贮存溶液

  10 mM Tris-HCl
  300 mM NaCl
  1 mM DTT
  0.1 mM EDTA
  500 µg/ml BSA
  50% Glycerol
  pH 7.4 @ 25℃

  热失活

  65℃ for 20 minutes

  甲基化敏感性

  dam 甲基化: 不敏感
  dcm 甲基化: 不敏感
  CpG甲基化: 不敏感

• 注意事项
  1. 此酶用于表观遗传学分析，底物 DNA 的两条链中均包含 CpG 甲基化位点，被 LpnPI 酶切后产生包含 CpG 甲基化位点的 32 bp 片段。对分离得到的 32 bp 片段进行测序可发现 5-mC 修饰位点（Cohen-Karni et al.,（2011）PNAS 108: 11040-11045）。
  2. 过量使用酶会抑制酶切。您需要优化每种底物 DNA 进行完全酶切所需的酶量。
  3. 延时酶切、高酶浓度或活化剂或甘油浓度 > 5% 等非理想的反应条件下可能出现星号活性，包括非甲基化 DNA 底物的酶切。每种底物 DNA 可能都需要优化酶量以实现高效的特异性切割，同时避免星号活性。
  4. 可通过以下方式实现 5-mC 位点的**特异性酶切：在 1X 酶激活溶液中，将 LpnPI 与 5-mC 识别位点的摩尔比介于 0.1:1 到 1:1 之间，酶切时间不超过 60 分钟。（LpnPI 的摩尔浓度约为 2.9 μM）。
  5. 对 CpG、dcm 或 dam 甲基化均不敏感。
  6. 延长酶切时间、高浓度酶或 >5% 的甘油浓度可能产生星号活性

• 参考文献
  1. Zheng, Y. et al. (2010). Nucl. Acids Res. doi:10, 1093/nar/gkq327.
  2. U.S. Publication No. 2010-0167942 Unpublished observation
  3. Cohen-Karni D et al. (2010). The MspJI family of modification dependent restriction endonucleases for epigenetic studies.. Proc. Natl Acad Sci U.S.A.. Jul 5;108(27), 11040-5.